Výraznou úlohu v 16.st. sehrály Litoměřice za povstání stavů proti panovníkovi v letech 1546-47. Příčinou neshod byly snahy Ferdinanda I. Habsburského omezovat pravomoci a tradice stavů (např. zákazem krajských sjezdů, vysíláním vojska za hranice atp.). Litoměřice stály po celou dobu tzv. 1. stavovského odboje na protikrálovské straně. Jak v roce 1546, tak 1547 svolával Ferdinand I. zemskou hotovost, kterou hodlal použít v tzv. šmalkaldské válce v Říši, kterou vedl jeho bratr Karel. Litoměřice byly povinny dodat zásoby i část jednotek. Vojsko se však scházelo liknavě a posléze české stavy úplně vypověděly Ferdinandovi poslušnost. Situace bylo pro ně příznivá do bitvy u Muhlbergu (24.4.1547), ve které katolická strana v Říši zvítězila, a tak se posílilo postavení Habsburka v Čechách. Právě v Litoměřicích na radnici, kam přijel Ferdinand 3.6.1547, přijímal omluvy vzbouřené šlechty a měst. Kdo se nepoddal, byl následně souzen. Litoměřice byly souzeny 21.7. velmi přísně – ztratily všechna privilegia, zbraně, majetek, většinu zdrojů příjmů (např. labské clo) a musely zaplatit vysokou pokutu 6000 kop grošů. Jejich autonomie byla omezena pouze na úřad královského rychtáře. I když amnestií ze září 1547 byla část práv vrácena a město dokázalo koupěmi a dary scelit svůj někdejší majetek, politicky již nikdy nehrálo takovou roli jako před odbojem.

  Národnostně v této době zůstávají Litoměřice převážně českým městem, vedle německé menšiny se v 16.st. objevuje ve městě zajímavá komunita – Italové. Šlo hlavně o stavitele a kameníky, kteří do města přinášejí módní renesanci. Počet obyvatel a domů k roku 1609: ve vnitřním městě asi 270 domů, na předměstích 440 domů, počet obyvatel asi 5000.

  Rostoucí město potřebovalo stále více vzdělanců. V 16.st. vzniká městská latinská škola s kolejí (v podstatě dnešní střední škola – obdoba gymnázia), existuje i škola při kapitule. Prameny hovoří o tom, že každý rok odcházelo 6-7 studentů z Litoměřic na Karlovu univerzitu, další pak na luteránskou univerzitu do Wittenbergu v Sasku. I asi nejznámější vzdělanec předbělohorské éry ve městě – městský písař Pavel Stránský ze Zapské Stránky (1583-1657, od r. 1608 rektorem latinské školy v LT, po sňatku s bohatou litoměřickou vdovou městským písařem a konšelem, r. 1618 vstupuje do 2. stavovského odboje, r. 1627 donucen odejít kvůli svému novoutrakvistickému vyznání do exilu, autor známého spisu „O státě českém“) píše ve svém nejznámějším díle o Litoměřicích jako o městě, v němž „mnozí učení mužové se narodili“.

  Velmi významné jsou Litoměřice jako centrum renesanční kultury v Čechách. Jsou dokonce po Praze a pernštejnských východních Čechách nejstarším nástupištěm renesančního umění u nás. Dvě památky jsou skutečně unikátní – malířské dílo Mistra litoměřického oltáře – deskový oltář pro kostel Všech svatých vzniklý na počátku 16.st., vykazující už principy raně renesančního malířství (6 zachovaných desek je v litoměřické Galerii výtvarného umění) a litoměřický graduál¹ z roku 1517 (kancionál) s celostránkovými ilustracemi také již renesanční provenience.

  Vedle těchto výtvarných památek pak mohou Litoměřice nabídnout řadu výrazných renesančních architektonických památek. Nový stavební sloh vstupuje do města po požáru v r. 1537. Je budován nový vodovod a kašny na náměstí, ale hlavně nová radnice (dnes muzeum) z dílny mistra Pavla, dokončená, jak říká nápis na pilíři s Rolandem, symbolem městských práv a obchodu, na jejím nároží r. 1539.

  Většina renesančních staveb je však spojena se jménem italského architekta Ambrože Balliho, zvaného Vlach, který ve městě působil od poloviny 50.let do r. 1576. Jde zejména o domy čp.12 na náměstí (Salva Guarda), čp.15 na náměstí (Kalich), čp. 25 na náměstí a čp.4 v Jezuitské ulici. Na některých z nich se dochovala i vynikající sgrafitová výzdoba (čp.12).